飼料中17種氨基酸的測定
發布時間：2020/2/20
氨基酸是動物的生長發育及動物體內營養物質的正常代謝所必須的重要組分，因此是評價飼料營養成分的一類重要指標，準確檢測氨基酸的含量和種類對于飼料質量評價和控制具有重要意義。本文采用柱前衍生法，可同時對飼料中的17種氨基酸進行分析測定。
一、實驗部分
1.1 儀器與試劑
LC1620A高效液相色譜儀（含UV檢測器1臺，P1620A高壓恒流泵2臺，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）
FA2004電子分析天平
恒溫箱
水解管（5型）
旋渦混勻器
氫氧火焰機
乙腈(色譜純，沃凱)
氨基酸標準品溶液（上海月旭）
超純水
2，4-二硝基氟苯（DNFB）、N,N-二甲基酰胺、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸（均為分析純）。
1.2 標準品溶液配制
1）氨基酸標準品溶液：氨基酸標準品溶液用水稀釋10倍到所需濃度（見表1）。
2）衍生化緩沖液的配制：稱取21g的NaHCO3于1L燒杯中，加水470mL，搖勻、溶解。過濾至500mL試劑瓶中，再加乙腈30mL，搖勻即得。
3）衍生化試劑：取1mL DNFB加入100mL定量瓶中，乙腈定容至刻度即得。
4）平衡溶液的配制 ：取KH2PO4 3.4g，加0.1mol/L的NaOH溶液145.5mL，加水至500mL，搖勻，過濾，貯存置棕色瓶中即得。
5）6mol/L鹽酸：取濃鹽酸500mL加入1L燒杯中，再加水500mL，搖勻即得。
1 十七種氨基酸濃度表
| | | | | | | |
|
| | | | | | | | 0.25 |
| | | | 0.25 | | | | 0.125 |
| | | | | | | | 0.25 |
| | | | 0.25 | | | | |
| | | | | | | | 0.25 |
| | | | 0.25 | | | | 0.25 |
| | | | | | | | 0.25 |
| | | | 0.25 | | | | 0.25 |
| | | | 0.25 | | | | - |
1.3 色譜條件：
色譜柱：Welch unitary Amino acid柱（4.6×250mm，5um）
流動相：A：40mM乙酸鈉緩沖液（冰醋酸調pH調至6.5）（含10mM N,N-二甲基酰胺）B：乙腈：水=1：1，梯度洗脫（見表2）
流速：1.2mL/min
柱溫：28℃
波長：360nm
進樣量：10ul
表2 梯度程序表
| No. | 時間(min) | 流動相(A %) | 流動相(B %) |
| 1 | 0 | 84 | 16 |
| 2 | 0.3 | 84 | 16 |
| 3 | 4 | 69 | 31 |
| 4 | 9.5 | 64 | 36 |
| 5 | 17 | 45 | 55 |
| 6 | 28 | 35 | 65 |
| 7 | 34 | 0 | 100 |
| 8 | 36 | 0 | 100 |
| 9 | 37 | 84 | 16 |
| 10 | 46 | 84 | 16 |
1.4 樣品前處理（氨基酸衍生化方法）
- 精確稱取研磨成細粉的樣本粉末200mg置于水解管中，加入6mol/L的鹽酸12mL，輕微震蕩。用氫氧火焰機融化水解管頸部*密封。
- 放于烘箱中145℃水解4小時，冷卻至室溫；
- 小心敲碎水解管頂部；把水解液及殘渣用漏斗和濾紙過濾，濾至50mL容量瓶中；再用水洗滌水解管，每次洗滌水均再次洗滌濾紙，反復6-7次，然后加水定容至容量瓶刻度；
- 用微量注射器取10ul定量好的溶液至1mL玻璃細管中，真空抽干（去HCl），然后依次加入衍生化緩沖液和衍生化試劑各20ul，渦旋30s，用多層密封帶封口；
- 置烘箱中64℃衍生化30min，冷卻至室溫；
- 加平衡緩沖液160ul，混勻30s，經0.45um濾膜過濾，作為待測樣品溶液。
實驗結果請參見文檔
